提取细胞质和细胞核蛋白的操作步骤

在细胞实验中提取细胞质和细胞核蛋白的操作步骤：

 

1.决定细胞生长状态，细胞生长状态应该是80%或者更好；

 

2.用离心机以1500r/min离心5min；

 

3.弃上清液，用等体积的冷PBS洗细胞，像步骤2那样，反复3次；

 

4.根据估计的沉淀量加入5倍体积的isotonic lysis buffer到细胞颗粒中，使细胞温和悬浮，尽量避免泡沫；

 

5.加入裂解液lysis buffer在悬浮的细胞中，并放在冰上15min让细胞膨胀，可以通过显微镜检查；

 

6.对于细胞实验中膨胀的细胞，加入10%的IGEPAL CA-630使*后的浓度达到0.3%，混匀，加的时候要温和；

 

7. 立即离心（量大的可以用1.5mlde EP管，以5500r/min离心30s；量大的可以用50ml的管子以5500r/min离心2min）；

 

8.转移上清液（细胞质蛋白）到一个新的冷冻管中；

 

9.用悬浮颗粒5倍体积的isotonic lysis buffer悬浮细胞，并混匀；

 

10.用离心机离心细胞悬浮液，以1500r/min离心5min，移掉上清液；

 

11.用2/3倍体积的extraction buffer悬浮颗粒；

 

12.把管子放置在震荡混匀器上，以700r/min，15min震荡混匀，接着以1400r/min,15min,整个过程要仔细，避免泡沫产生；

 

13.以9400r/min离心15min，离心完后转移上清液到一个新的冷冻离心管中；

 

14.分成几份用液氮冷冻，并且保存起来（长期保存应放在-80℃上，短期保存要放在-20℃上）。