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做转染前这 5 条一定要注意

发布时间：2021-09-01 14:22 点击次数：

转染技术是指将外源分子如 DNA、RNA 等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上主要的转染试剂类型的选择。

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-96 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（ APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：

1. 细胞培养物

健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前 24 小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源 DNA 摄入的可能。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。

2. 血清

大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右)试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源 DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。

3. 载体构建

转染载体的构建（病毒载体，质粒 DNA，RNA，PCR 产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性 DNA 对瞬时和稳定转染的 影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

4. DNA 质量

DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界品牌德国 QIAGEN 公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍 2 x CsCl 梯度离心以上的纯度效果，使您不必为 DNA 质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN 还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。

5.转染技术

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如 DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下：

转染方法、原理及应用

DEAE- 右旋糖苷法带正电的 DEAE- 右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清。
  • 磷酸钙法
磷酸钙 DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，瞬时性转染不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用。
  • 电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定转染，瞬时性转染，所有细胞适用性广但细胞致死率高，DNA 和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。
  • 阳离子性的脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染。
瞬时性转染，所有细胞适用性广，转染效率高，重复性好但转染时需除血清。
转染效果随细胞类型变化大。
  • 病毒介导法
逆转录病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染，特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大。
细胞需处分裂期，需考虑安全因素 ，腺病毒瞬时转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞，需考虑安全因素。
  • Biolistic 颗粒传递法
将 DNA 用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA 在胞内逐步释放，表达瞬时性转染 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞。
  • 显微注射法
用显微操作将 DNA 直接注入靶细胞核稳定转染，瞬时性转染 转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。