免疫组化实验过程中的要点与技巧

                                   免疫组化实验过程中的要点与技巧


免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
    免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
操作要点和技巧 
1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
    Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
    PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
    2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
    3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
    4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
    5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
    6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液， 适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况 下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
    7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
    8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液 请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶 消化等。
    9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
    10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
    11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
    12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
    13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
    14.     在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色