实时定量PCR (qPCR) 服务

 实时定量PCR (qPCR) 服务


技术原理
Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信 号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR技术具有特异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。

服务流程（含逆转录）
1、RNA的提取
2、DNase I 消化样品RNA 中的DNA
3、RNA琼脂糖凝胶电泳
4、RNA反转录为cDNA
5、引物设计合成、探针设计合成（探针法）

Real-Time PCR引物设计的要求
① Tm=55~65 oC
② GC=30~80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80~300 bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在60oC以上。选择特异性好，扩增效率高的引物。

实时定量PCR反应
　　常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA

扩增曲线和溶解曲线（溶解曲线仅染料法提供）
　　溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。